Les méthodes de microscopie en molécule unique notamment le suivi de particules uniques (single particle tracking, SPT) permettent d’observer directement le déplacement de molécules biologiques individuelles au sein de cellules vivantes. Les comportements spécifiques de protéines sont autant d’indices qui aident à révéler les processus biologiques sous-jacent. Néanmoins ces techniques sont entachées de plusieurs problèmes majeurs : faible contraste due au fort signal de luminescence du fond, photo-blanchiment et photo-clignotement lors de l’utilisation de fluorophores organiques ou boîtes quantiques (QDs) comme marqueurs fluorescents.
Ces désavantages peuvent être évités en utilisant une nouvelle famille de luminophore appelée nanoparticules à conversion ascendante (UCNPs). Les UCNPs sont des nanoparticules (5-100 nm) à base de fluorure ou d’oxydes, dopées par des lanthanides qui leur confèrent une propriété unique par rapport aux autres fluorophores. En effet, les UCNPs réémettent des photons dans la gamme du visible après excitation par de la lumière proche infrarouge (émission anti-Stokes). Ce phénomène de conversion ascendante est très efficace comparativement à l’absorption à deux photons, cette propriété très singulière permet de les détecter avec un rapport signal sur bruit élevé, même dans un environnement complexe. Par ailleurs, l’émission des UCNPs est parfaitement stable, sans diminution de luminescence ni clignotement au cours du temps même après plusieurs heures d’illumination. Toutes ces caractéristiques expliquent l’intérêt particulier qui est porté aux UCNPs dans le cadre de la microscopie de fluorescence.
Au laboratoire nous avons développé des instruments adaptés à la photo-physique particulière de ces objets afin de pouvoir caractériser leurs propriétés optiques (spectroscopie à l’état stationnaire et résolue en temps) au cours de mesures d’ensemble et de mesures à l’échelle de la particule unique. Nous avons également développé un instrument dédié à l’application des UCNPs pour le suivi de molécules uniques à la membrane plasmique de cellules vivantes.
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1 - Spectroscopie dédiée à la conversion ascendante de photons
Cet instrument est dédié à la caractérisation d’échantillons en solution préparés dans des cuvettes (volume minimal de 100µL). Le faisceau d’excitation issue soit d’une diode laser fibrée soit d’un laser Titane-Saphir est focalisé dans la cuvette et l’émission collectée à 90° par un objectif de microscope est collectée soit par un spectrophotomètre (mesure à l’état stationnaire) soit par une photodiode à avalanche (mesure résolue en temps).
Figure 1. (a) Schéma du banc optique dédié à la spectroscopie résolue en temps. (b) Exemple de déclin de luminescence d’une dispersion d’UCNPs et (c) distribution de temps de vie obtenue par une analyse basée sur le maximum d’entropie.
Les sources, détecteur et cartes électroniques du spectromètre sont partagées de avec le microscope confocal (voir le détail de la configuration matérielle ci-dessous).
2 - Microscopie à conversion ascendante de photons en configuration confocale
Construit autour d’un microscope inversé commercial ce système permet d’illuminer l’échantillon en mode confocal avec un faisceau laser issue d’une diode laser fibrée proche infrarouge ou d’un laser Titane-Saphir. L’émission est collectée par une photodiode à avalanche. Une platine piezo rapide permet de construire l’image en balayant l’échantillon à travers le volume focal. Dans le cas des mesures résolue en temps la puissance du faisceau d’excitation est soit directement modulé électroniquement via une carte d’entrée/sorties multifonctions, soit modulé optiquement via un modulateur acousto-optique. Les évènements correspondant à la détection de photons uniques ainsi que le signal de synchronisation sont enregistrés par un module commercial de comptage de photons uniques corrélés en temps. Le système est piloté par labVIEW.
Figure 2. (a) Schéma du microscope à conversion ascendante de photons en configuration confocale. (b) Image confocale de 20x20µm2 obtenue en scannant un échantillon préparé en séchant des UCNPs sur une lamelle de microscopie. (c) Déclin de luminescence de l’UCNP entourée en rouge sur le cadrant (b)
Statif
Nikon TiE.
Objectif
Nikon, Plan Apo λ 100x/1.45 Oil.
Sources
- λ = 975nm, Qphotonics, QFBGLD-980-350
- λ = 750-1000nm, Spectra-Physics, Tsunami
Détecteur
- Excelitas, SPCM-AQRH-16
Platine piezo
- Piezoconcept, LFHS3
Modulateur acousto-optique
- AAoptoelectronic, MODA80-B4-34
Cartes électroniques
- National Instruments, PCIe 6711
- National Instruments multifunction board, PCIe 6361
- Becker-Hickl, SPC-830
Interface Logicielle
- National Instruments, LabVIEW
3 - Microscopie à conversion ascendante de photons en configuration champ large
Construit autour d’un microscope inversé commercial ce système permet d’illuminer l’échantillon en mode EPI , Hi-Lo ou TIRF avec un faisceau laser issue d’une diode laser fibrée proche infrarouge, d’une diode laser 532nm ou d’un laser HeNe 633nm. Le signal de luminescence est détecté par une caméra em-CCD au travers d’un module optique offrant la possibilité d’imager simultanément dans deux bandes spectrales. Le système est piloté par µManager et est équipé d’une enceinte thermostatée.
Figure 3.(a)Schéma du microscope à conversion ascendante de photons en configuration champ large. (b) Image champ large de 144x144µm2 d’UCNPs immobilisées en solution sur une lamelle de microscopie recouverte de polyethylenimine. (c) Agrandissement correspondant à la zone d’intérêt encadrée en rouge sur le cadrant (b).
Statif
- Olympus IX-71
Objectif
- Olympus, UApo N 100x/1.49 Oil
Sources
- λ = 975nm, Qphotonics, QFBGLD-980-350
- λ = 633nm, LASOS, LGK 7665 P18
- λ = 532nm, Integrated-Optics, 532L-15
Détecteur
- Hamamatsu, ImagEM X2 C9100-23B
Platine
- Märzhäuser Wetzlar, SCAN IM
Image splitting system
- Hamamatsu, W-VIEW GEMINI
Interface Logicielle
- µManager
Publications
1. Dukhno, O. et al. Quantitative assessment of energy transfer in upconverting nanoparticles grafted with organic dyes. Nanoscale 9, 11994–12004 (2017).
2. Dukhno, O. et al. Time-dependent luminescence loss for individual upconversion nanoparticles upon dilution in aqueous solution. Nanoscale 10, 15904–15910 (2018).
3. Nonat, A. et al. Molecular Upconversion in Water in Heteropolynuclear Supramolecular Tb/Yb Assemblies. J. Am. Chem. Soc. 141, 1568–1576 (2019).
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