Ce système de microscopie de molécule unique développé au laboratoire a la particularité d’être très modulaire, le déplacement d’un seul élément optique permet de passer en 3D ou en spectral. Il a été initialement développé pour de l’imagerie bactérienne en single molecule tracking et en super résolution spectrale pour des quantifications de fluorescence en time lapse à température ambiante.
Spectral PAINT (SMLM spectrale)
Un réseau de diffraction est placé sur le trajet optique de la lumière émise. Sur une première moitié du capteur de la caméra on retrouve la lumière non diffractée (ordre 0) qui permet de localiser le spot de particule unique. Sur l’autre moitié de la caméra on projette le spectre (diffraction d’ordre 1). Après reconstruction on obtient une image super-résolue (50nm en XY) avec un spectre pour chaque pixel (stack spectral).
SMLM (Single Molecule Localization Microscopy)
L’imagerie à haute résolution, la nanoscopie, permet de dépasser les barrières physiques de la diffraction en atteignant une résolution latérale de 25 nm. Dans la microscopie de localisation par photoactivation (PALM : PhotoActivated Localization Microscopy) et la microscopie par reconstruction stochastique optique (STORM : Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), quelques molécules sont activées, imagées, puis éteintes ou photoblanchies. Une image en deçà de la limite de diffraction est alors reconstruite après avoir déterminé avec une haute précision la position de toutes les molécules individuelles.
3D SMLM (astigmatisme)
Une lentille cylindrique est placée sur le trajet optique, l’image d’une molécule unique donne une tache de diffraction dissymétrique. Cette dissymétrie permet de connaître la position de la particule par rapport au plan de focus avec une résolution axiale de 50 nm.
TIRF / HILO (Total Internal Reflection Fluorescence / Highly Inclined and Laminated Optical sheet)
L’imagerie TIRF consiste à illuminer à l’angle critique de réflexion, l’échantillon est alors excité par un phénomène d’ondes évanescentes sur les 40 premiers nanomètres. L’imagerie HILO ou pseudo-tirf est un dispositif d’illumination oblique (proche de l’angle critique) permettant une imagerie en champ large sur une profondeur de champ réduite qui baisse le bruit de fond généré par les plans hors focus. Ces modes d’imagerie peuvent être utilisés conventionnellement ou en SMLM. Epifluorescence : L’imagerie de fluorescence en champ large est réalisable en utilisant les lasers comme source d’excitation.
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Caractéristiques techniques
Modes d’acquisition
- spectral PAINT
- PALM/dSTORM/PAINT
- Microscopie en contraste de phase
- Microscopie de Fluorescence à champ large
- TIRF/HILO
- Couplage avec microfluidique
Statif
- Olympus IX 81 avec autofocus and z drift control (ZDC)
- Platine motorisée Marzäuser SCAN IM 120 x 80
Lasers
- 405 nm
- 488 nm 100mW
- 532 nm 110mW
- 561 nm 300mW
- 645 nm 100mW
Objectifs disponibles (Olympus)
- 100X 1.4 UplanSApo Oil PH3
- 60X 1.2
- 20X 0.4 Lc Plan PH 1
- 10X 0.3 SPlan
Camera
- EMCCD (ImagEM hamamatsu)
Accessoires
- Couplage microfluidique (CellAsics - Merk)
Interface
- Micromanager
N’oubliez pas de citer la plateforme dans les remerciements